Сравнение показателей агрегации тромбоцитов и экспрессии маркеров тромбоцитарных гранул

УДК 616.155.2

Аннотация

Введение. Активация тромбоцитов стимулирует их агрегацию и ассоциированный с секрецией экзоцитоз внутриклеточ- ных гранул. Агрегацию чаще всего изучают турбидиметрическим методом, а экзоцитоз гранул — методом проточной ци- тофлуориметрии, определяя экспрессию их маркеров на поверхности тромбоцитов.

Цель исследования: сравнение чувствительности двух методов оценки активации тромбоцитов, исследования их агрега- ции и экспрессии маркеров внутриклеточных гранул.

Материалы и методы. Тромбоциты здоровых доноров активировали АДФ и пептидом, активирующим рецептор тромбина (thrombin receptor activating peptide, TRAP). Агрегацию тромбоцитов изучали турбидиметрическим методом в обогащен- ной тромбоцитами плазме, регистрируя максимальный уровень светопропускания (Т% макс). Экспрессию маркеров гра- нул изучали в цельной крови с помощью проточной цитофлуориметрии, регистрируя процент тромбоцитов, окрашенных антителами против маркеров альфа-гранул (CD62P+) и плотных гранул (CD63+).

Результаты. У всех доноров 20 мкМ АДФ и 10 мкМ TRAP стимулировали мощную, необратимую агрегацию тромбоцитов (62,1 ± 10,3 и 65,1 ± 5,1 T% макс, соответственно). Средние уровни агрегации были ниже при ее стимуляции 2,5 мкМ АДФ (30,9 ± 23,2 T% макс) и 1 мкМ TRAP (24,4±29,1 T% макс). Экспрессия маркеров гранул была максимальной при активации тромбоцитов 10 мкМ TRAP (77,6 ± 13,7% CD62P+ и 73,9 ± 13,3% CD63+), ниже при активации 1 мкМ TRAP (46,3 ± 25,1% CD62P+ и 38,3 ± 23,8% CD63+), еще ниже при активации 20 мкМ АДФ (19,8±8,5% CD62P+ и 13,6±5,2% CD63+) и минимальной при активации 2,5 мкМ АДФ (8,0 ± 4,2% CD62P+ и 8,3± 3,3% CD63+). Адреналин (20 мкМ) не стимулировал экспрессию маркеров гранул, но при совместном добавлении с 20 мкМ АДФ повышал ее в 1,9 раза для обоих маркеров — CD62P и CD63.

Заключение. При активации тромбоцитов АДФ исследование агрегации является более чувствительным методом, чем определение экспрессии маркеров гранул. При активации тромбоцитов TRAP чувствительность обоих методов приблизи- тельно одинакова. Экспрессия маркеров гранул увеличивается при совместном добавлении к тромбоцитам АДФ и адре- налина, хотя адреналин сам по себе не стимулирует их экспрессию.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов. М.: Лит- терра. 2011. 480 с.

2. Born G.V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphos- phate and its reversal. Nature. 1962;9(194):927–9.

3. O’Brian J. Platelet aggregation. Part II. Some results from a new method of study. J Clin Pathol. 1962;15:452–81.

4. Hayward C.P.M., Moffat K.A. Platelet aggregation. In: Platelets in thrombotic and non-thrombotic disorders. Pathophysiology, phar- macology and therapeutics: an update. Eds. P. Gresele, N.S. Klei- man, J.A. Lopez, C.P. Page. Switzerland: Springer, 2017. 619–35.

5. Berny-Lang M.A., Frelinger A.L. III, Barnard M.R., Michel- son A.D. Flow cytometry. In: Platelets. 3rd edition. Ed. A.D. Mi- chelson. Amsterdam: Elsevier Inc. Academic Press, 2013. 581–602.

6. Frelinger A.L. III. Using flow cytometry to monitor glycopro- tein IIb-IIIa activation. Platelets. 2018;29(7):670–6. DOI: 10.1080/09537104.2018.1478073.

7. Flaumenhaft R. Platelet secretion. In: Platelets. 3rd edition. Ed. A.D. Michelson. Amsterdam: Elsevier Inc. Academic Press, 2013. 343–66.

8. Mirlashari M.R., Ryningen A., Mikkelsen H.M., Fukami M.H. Dif- ferential secretion of blood platelet storage granules. Platelets. 1996;7(5–6):313–20.

9. Cattaneo M. The platelet P2 receptors. In: Platelets. 3rd edition. Ed. A.D. Michelson. Amsterdam: Elsevier Inc. Academic Press, 2013. 261–82.

10. ZhangP.,CovicL.,KuliopulosA.Protease-activatedreceptors.In: Platelets. 3rd edition. Ed. A.D. Michelson. Amsterdam: Elsevier Inc. Academic Press, 2013. 249–60.

1. Hui K.Y., Jakubowski J.A., Wyss V.L., Angleton E.L. Minimal se- quence requirement of thrombin receptor agonist peptide. Biochem Biophys Res Commun. 1992;184:790–6.

2. Rand M.L., Perry D.W., Packham M.A. et al. Conditions influenc- ing release of granule contents from human platelets in citrated plasma induced by ADP or the thrombin receptor activating pep- tide SFLLRN: direct measurement of percent release of beta-throm- boglobulin and assessment by flow cytometry of P-selectin expres- sion. Am J Hematol. 1996;52(4):288–94.

3. Furman M.I., Benoit S.E., Barnard M.R. et al. Increased plate- let reactivity and circulating monocyte-platelet aggregates in patients with stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 1998;31(2):352–8.

4. Ogawa T., Sugidachi A., Otsuguro K. et al. Platelet alpha-granule secretion and its modification by SC-57101A, a GPIIb/IIIa antag- onist. Biochem Pharmacol. 2002;63(10):1911–8. DOI: 10.1016/ s0006–2952(02)00976–0.

5. Наймушин Я.А, Мазуров А.В. Роль гликопротеина IIb-IIIa (αIIbβ3-интегрина) в стимуляции секреции из гранул тром- боцитов. Биохимия. 2003;68(2):250–9.

6. Yakushkin V.V., Zyuryaev I.T., Khaspekova S.G. et al. Glycoprotein IIb-IIIa content and platelet aggregation in healthy volunteers and patients with acute coronary syndrome. Platelets. 2011;22(4):243– 51. DOI: 10.3109/09537104.2010.547959.

7. Хаспекова. С.Г., Зюряев И.Т., Якушкин В.В. и др. Средний объем тромбоцитов: взаимосвязи с агрегационной активно- стью тромбоцитов и уровнем экспрессии гликопротеиновIIb- IIIa и Ib. Биомедицинская химия. 2014;60:94–108.

8. Lanza F., Cazenave J.P. Studies of alpha 2-adrenergic receptors of intact and functional washed human platelets by binding of 3H-di- hydroergocryptine and 3H-yohimbine — correlation of 3H-yo- himbine binding with the potentiation by adrenaline of ADP-in- duced aggregation. Thromb Haemost. 1985;54(2):402–8.

9. Singh S., Malm C.J., Ramström S. et al. Adrenaline enhances in vitro platelet activation and aggregation in blood samples from ticagre- lor-treated patients. Res Pract Thromb Haemost. 2018;2(4):718– 25. DOI: 10.1002/rth2.12149.

10. Fox S.C., May J.A., Shah A. et al. Measurement of platelet P-se- lectin for remote testing of platelet function during treatment with clopidogrel and/or aspirin. Platelets. 2009;20(4):250–9. DOI: 10.1080/09537100902912451.

11. Dovlatova N., Lordkipanidzé M., Lowe G.C. et al. Evaluation of a whole blood remote platelet function test for the diagnosis of mild bleeding disorders. J Thromb Haemost. 2014;12(5):660–5. DOI: 10.1111/jth.12555.